Menu
01.08.2014 Аникей 2 комментариев

У нас вы можете скачать книгу Тритерпеновые и стероидные гликозиды и мембраны Галина Лихацкая в fb2, txt, PDF, EPUB, doc, rtf, jar, djvu, lrf!

Saponins in Food, Feedstuffs and Medicinal Plants. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, New York, Plenum Press, Toxins from sea cucumbers Holothuroids: Строение и биологическая активность стероидных гликозидов ряда спиростана и фуростана. Стероидные гликозиды ряда спиростана: Saponins and phenolics of Yucca schidigera Roezl: Molecular interaction in monolayers.

Липиды и ионная проницаемость мембран. Большая научная энциклопедия, The bioactivity of saponins: Betulinic acid and its derivatives: Fungitoxic activity of saponins: Биологическая активность и фармакологические перспективы лупановых тритерпеноидов: Биологическая активность и фармакологические перспективы лупановых тритерпеноидов. Anti-inflammatory activities of thetriterpene acids from the resin of Boswellia carteri 11J Ethnopharmacol.

Tschesche R, Wulff G. О, Mao G, Mukherjee R. Об устойчивости клеток голотурии Stichopus japonicus S. Hydration of lipid films with an aqueous solution of Quil A: Ben-Hur E, Fulder S. In Vivo radioprotective effect of Panax ginseng C. Antiproliferative terpenoids from almond hulls Prunus dulcis: Влияние некоторых тритерпеновых и стероидных соединений на рост каллусной культуры Panax ginseng С.

Влияние тритерпеновых гликозидов голотурии Cucumaria japonica на рост корня проростков Cucumis sativus L. Гиперосмотический гемолиз и антигемолитическая активность сапониновой фракции и тритерпеновых гликозидов женьшеня Panax ginseng С.

Изучение мембранотропной активности некоторых тритерпеновых гликозидов: Phosphatidylcholine liposomes containing the saponin aglicone diosgenin or tigogenin on place of cholesterol. Физико-химия углеводородных пленок М.: Динамическая структура липидного бислоя. Липидный бислой биологических мембран.

Ионные каналы, образуемые антибиотиками. Итоги науки и техники. E, Bowyer P, Ladha S. Malkin Т, Shyrbagy M. An X-Ray and thermal examination of the glycerides. Mueller P, Rudin D. Physical properties of biological membranes and their functional implications ed. New York, Plenum Press. Antifungal activities and action mechanisms of compounds from Tribulus terrestris L. Signal Transduction in Plants ed. О механизме активирующего действия Са - ионофоров на интактные клетки: Механизмы взаимодействия тритерпеновых и стероидных гликозидов с липидными мембранами тема диссертации и автореферата по ВАК Взаимодействие тритерпеновых и стероидных гликозидов с мембранами.

К началу наших исследований связь структуры голотуринов и их каналообразующей активности была не изучена. В ТИБОХ ДВО РАН были выделены индивидуальные голотурины, их десульфатированные производные и свободные агликоны голотуриногенины , которые были использованы при исследовании связи структура-активность голотуринов рис.

Величина проводимости и время флуктуаций свидетельствует об образовании одиночных ионных каналов в БЛМ. Время жизни ионных каналов в открытом состоянии подчиняется одноэкспоненциальному распределению рис. Ионные каналы, образованные голотурином А2 в БЛМ, содержащих холестерин, имели наиболее вероятную проводимость в 2 раза меньше, чем типичные грамицидиновые каналы Hladky and Haydon, и почти в 10 раз больше, чем проводимость ионных каналов, образованных полиеновым антибиотиком амфотерицином В Ermishkin et al.

Вольтамперная характеристика одиночного канала линейна. Структура тритерпеновых гликозидов голотурий голотуринов , их десульфатированных производных и голотуриногенинов А2 и А. При создании градиента концентрации КCl с одной стороны БЛМ знак и величина мембранного потенциала указывают на слабую катионную селективность голотуриновых каналов.

Регистрируемые каналы большой проводимости неселективные водонаполненные поры образуются за счет включения большего числа субъединичных комплексов в структуру голотуриновых каналов. Действие гликозида на проводимость БЛМ, содержащих разные стерины, коррелирует с действием этого гликозида на проницаемость клеточных мембран, содержащих холестерин и эргостерин. Гликозид голотурин В1 при добавлении в водную фазу БЛМ, содержащих холестерин или эргостерин, вызывает дискретные флуктуации тока канального типа рис.

Вид стерина влияет как на величину проводимости одиночных каналов, так и на среднее время жизни каналов в открытом состоянии. При введении голотуриногенина до концентрации М как в водную фазу, так и в липидный раствор для формирования БЛМ, не наблюдается увеличение проводимости мембран рис. Проведена оценка размеров формируемых голотуринами ионных каналов и пор по ингибированию голотуринового гемолиза молекулами полиэтиленгликолей с определенной молекулярной массой рис.

Показано, что в присутствии голотурина А2 образуются поры большего размера, чем в присутствии голотурина В1 рис.

Полученные данные свидетельствуют о корреляции действия голотуринов на модельные и клеточные мембраны, содержащие холестерин.

Таким образом, для голотуринов А2 и В1 показано, что механизм изменения ионной проницаемости в присутствии этих гликозидов состоит при низких концентрациях в образовании ион-селективных одиночных каналов, а при высоких концентрациях в образовании неселективных водонаполненных пор, размер которых определяется размером углеводной части молекул голотуринов.

Отсутствие углеводной цепи у голотуриногенина приводит к потере каналообразующей активности и отсутствию дестабилизирующего действия на мембраны. Обнаружено, что десульфатирование оказывает незначительное влияние на активность гликозида с линейной тетрасахаридной углеводной частью и открытой боковой цепью в агликоне рис. Активность голотурина А, с окисленной и замкнутой боковой цепью в агликоне, ниже, чем у голотурина А2, и существенно снижается при отсутствии сульфогруппы в углеводной цепи рис.

Замкнутая боковая цепь приводит к увеличению действующей концентрации и изменению параметров ионных каналов в БЛМ. Взаимодействие голотуринов различного строения с липидными мембранами изучено высокочувствительным методом дифференциальной сканирующей микрокалориметрии ДСК , который позволяет определить природу возмущений в липидном бислое, локализацию и характер взаимодействия молекул в мембране по изменению параметров фазового перехода ДПФХ, термотропное поведение которого наиболее изучено.

Диаметр определен по ингибированию голотуринового гемолиза полиэтиленгликолями разного размера. Действие голотурина А2 на фазовый переход ДПФХ в низких концентрациях проявляется в изменении параметров предперехода, снижении температуры, отвечающей пику предперехода, и уменьшении его энтальпии, что свидетельствует об изменении наклона жирнокислотных цепей ДПФХ по отношению к плоскости бислоя в присутствии голотурина.

С увеличением концентрации голотурина А2 рис. Температурный диапазон фазового перехода в присутствии голотурина А2 увеличивается и сдвигается в низкотемпературную область рис.

Характер изменений термограмм ДПФХ свидетельствует о выраженном взаимодействии голотурина с липидным бислоем и о латеральном разделение фаз в липидном бислое. Голотурин В1 оказывает аналогичное действие, вызывая латеральное разделение фаз в мембране, но в меньшей степени сдвигает фазовый переход в низкотемпературную область, чем голотурин А2.

Голотуриногенин А2 изменяет энтальнию и кооперативность основного фазового перехода ДПФХ и оказывает стериноподобный эффект.

Обнаружено, что голотуриногенин А с окисленной и замкнутой боковой цепью влияет на термотропный фазовый переход при более высоких концентрациях и слабее взаимодействует с гидрофобной областью мембран, по сравнению с голотуриногенином А2. Анализ зависимости изменения относительной энтальпии фазового перехода ДПФХ от концентрации исследуемых соединений показал, что для голотуринов с тетрасахаридной углеводной частью наблюдается более резкое уменьшение относительной энтальпии, чем для гликозида с дисахаридной углеводной частью.

В присутствии голотурина А изменение энтальпии и температуры фазового перехода рис. Калориметрические данные коррелируют с меньшей активность голотурина А и стериноподобным стабилизирующим действием голотуриногенинов на проницаемость мембран.

Введение стерина в мембраны снижает действующую концентрацию гликозида в раз. Стехиометрия комплексов голотурина А2: Показано, что в мембране образуются комплексы холестерина с агликонной частью молекул гликозидов и комплексы остаются в мембране. Доказано, что ионпроводящие свойства комплексов свободного и гликозилированного тритерпеноидов различны. При реконструкции в БЛМ из ДПФХ комплексы гликозилированного тритерпеноида увеличивают ионную проницаемость мембран, а комплексы свободного тритерпеноида нет рис.

По-видимому, различное действие гликозида и его генина на свойства мембран обусловлено разной формой образуемых комплексов. В случае гликозида комплекс имеет форму, увеличивающую положительную кривизну липидного бислоя, а комплекс свободного агликона нет рис. На основании полученных данных можно сделать вывод, что главную роль в комплексообразовании голотуринов с холестерином играет гидрофобное взаимодействие агликонной части молекулы гликозида и циклопентанпергидрофенантренового цикла холестерина.

Изучена мембранная активность серии тритерпеновых гликозидов голотурий кукумариозидов , которые отличаются количеством моносахаридных остатков, количеством и местом присоединения сульфатных групп, строением агликона и наличием 3-О-метильной группы в конечном моносахаридном остатке табл.

Фазовый переход в липосомах из ДПФХ, содержащих холестерин, в присутствии голотуриногенина а и голотурина А2. Водная фаза 0,1 М KCl, 5 mM Tris-HCl, pH 7,2 Гликозид с двумя моносахаридными остатками при С-3 агликона оказывает действие на ионную проницаемость при более низких концентрациях, чем монозид.

Присоединение сульфатной группы к первому моносахаридному остатку биозида снижает действующую концентрацию на порядок и повышает активность гликозида. Увеличение активности происходит в такой же мере, как и присоединение к углеводной цепи биозида дополнительно двух моносахаридов или в тетразиде.

Вклад сульфатной группы при первом моносахариде уменьшается с увеличением размера углеводной цепи. Сульфатная группа усиливает действие малоактивных гликозидов голотурий в большей степени, чем активных гликозидов. Обнаружено, что отсутствие метильной группы в конечном моносахаридном остатке гликозидов и наличие двух сульфатных групп в углеводной цепи снижает активность гликозидов, но причины такого изменения активности молекул были не ясны.

Поэтому мы изучили влияние серии гликозидов табл. Обнаружено, что активность десульфатированных гликозидов, молекулы которых отличаются только наличием или отсутствием метильной или ацетатной групп в конечном моносахаридном остатке углеводной цепи, изменяется в ряду: Показано, что кукумариозид A активнее кукумариозида A При наличии сульфатной группы в первом моносахаридном остатке гликозид с 3-О-метильной группой в углеводной цепи активнее, чем гликозид без такой группы.

Гликозиды А и А3 с двумя сульфатными группами в углеводной цепи, в зависимости от места их присоединения, проявляют различную активность по сравнению с моносульфатированным гликозидом кукумариозидом А Методом ДСК изучено взаимодействие кукумариозидов и их десульфатированных производных с липидными мембранами рис. Показано, что присутствие второй сульфатной группы в углеводной цепи молекул гликозидов уменьшает гидрофобное взаимодействие молекул с липидным бислоем.

Для десульфатированных гликозидов обнаружено, что 3-О-метильная и 6-О-ацетатная группы в концевом моносахаридном остатке усиливают гидрофобное взаимодействие молекул с липидным бислоем. Полученные данные позволили предположить, что причина более высокой мембранной активности гликозидов с неполярными функциональными группами в концевом моносахаридном остатке углеводной цепи состоит в более сильном возмущающем действии их на структуру липидного бислоя.

Аналогичная закономерность - более высокая активность гликозидов с неполярными функциональными группами в концевом моносахаридном остатке углеводной цепи обнаружена для стероидных гликозидов, выделенных из растений Mimaki et al, , что указывает на общие пути изменения активности как тритерпеновых, так и стероидных гликозидов. При действии высоких концентраций гликозида образуются неселективные поры. Действие гликозида на проводимость БЛМ в концентрации 0,5 нМ проявляется в образовании каналов с проводимостью пСм.

При концентрации кукумариозида А М наблюдается структурный переход бислойных мембран в небислойные структуры, который более эффективен для мембран с большим содержанием холестерина. А в таблице 1 и Б в таблице 2. Данные приведены в двойном логарифмическом масштабе. Таким образом, показано, что исследованные тритерпеновые гликозиды голотурий образуют ионные каналы и поры в мембранах, содержащих стерины, изменяют физическое состояние липидного бислоя и вызывают латеральное разделение фаз в мембранах.

Поэтому при действии на клетки эти соединения могут регулировать клеточную активность, изменяя как ионный гомеостаз клеток, так и физическое состояние клеточных мембран. Тритерпеновые гликозиды хедерагениа широко распространены в высших растениях. Из дальневосточного растения Caulophyllum robustum Max. Изучена каналообразующая активность этих гликозидов и их действие на термотропное поведение липидных мембран.

При введении каулозида С в водную фазу наблюдаются дискретные флуктуации тока через БЛМ рис. Проводимость мембран зависит от концентрации гликозида, липидного состава мембран и рН среды.

Времена жизни одиночных каналов распределены по одноэкспотенциальному закону, а среднее время жизни каналов равно 20 секундам. При введении холестерина в мембраны проводимость мембран увеличивается на порядка по сравнению с БЛМ без стерина рис.

Гликозид с меньшим размером углеводной части каулозид А также формирует ионные каналы в мембранах рис. Мембранная активность гликозидов хедерагенина зависит от строения агликона и углеводной части молекул, структуры и содержания мембранного стерина и рН среды. Обнаружено, что гидрофобное взаимодействие гликозидов с липидным бислоем и их каналообразующая активность увеличиваются, когда карбоксильная группа при С агликона протонирована или метилирована, и гликозид с большим размером углеводной части проявляет более эффективное действие на проницаемость мембран рис.

Гликозиды хедерагенина увеличивают проницаемость клеточных и модельных мембран, образуя в низких концентрациях ион-селективные каналы, а в высоких концентрациях неселективные водонаполненные поры. В результате этого гликозиды в низких концентрациях оказывают стимулирующее действие на клетки, а в высоких - могут ингибировать пролиферацию клеток.

Методом ДСК показано, что взаимодействие гликозидов хедерагенина с липидным бислоем зависит от рН водной фазы рис.

В нейтральной среде гликозиды слабее взаимодействуют с гидрофобной областью мембран. Предложен новый биохимический инструмент для научных исследований на основе гликозида хедерагенина для регулируемого изменения проницаемости мембран.

Полученные данные по свойствам ионных каналов, образованных тритерпеновыми гликозидами, и по влиянию гликозидов и их генинов на термотропное поведение мембран могут найти применение в научно-исследовательских лабораториях.

Результаты диссертационного исследования используются при чтении спецкурса для студентов, а также при выполнении курсовых и дипломных работ. Обоснованность и достоверность результатов подтверждается использованием современных биофизических методов исследования мембран и способов обработки полученных экспериментальных данных.

П о теме диссертации опубликовано 16 работ. Личный вклад автора состоит в том, что им самостоятельно получены экспериментальные данные по влиянию исследуемых соединений на ионную проницаемость и термотропное поведение мембран, проведена обработка и интерпретация полученных данных и написаны соответствующие разделы статей.

Структура и объем работы Работа состоит из введения, литературного обзора, материалов и методов исследования, полученных экспериментальных результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего цитируемых работ.

Работа изложена на страницах, содержит 10 таблиц и 37 рисунков. Взаимодействие гликозидов с клеточной мембраной является первым этапом в действии гликозидов на клетки. Действие гликозидов на этом этапе проявляется в нарушении структуры и избирательной проницаемости клеточных мембран.

В присутствии гликозидов обнаружено увеличение выхода ионов из клеток, а также УФ-поглощающих веществ нуклсотидного пула. Показано, что в зависимости от типа клеток, структурных особенностей гликозида и его концентрации наблюдается либо постепенное изменение проницаемости мембран, когда гликозиды в низких концентрациях вызывают выход ионов из клеток, а с увеличением концентрации наблюдается выход УФ-поглощающих веществ, либо одновременное увеличение проницаемости для ионов и УФ-поглощающих веществ [20].

Показано, что чувствительность клеток к действию гликозидов зависит от содержания стерштов в плазматических мембранах. Включение экзогенного холестерина в клеточные мембраны повышает чувствительность клеток к действию гликозидов [, ]. В экспериментах на липосомах было показано, что проницаемость липосом в присутствии гликозидов возрастает с увеличением содержания холестерина в липосомальной мембране. Липосомы без стерина не изменяли своей проницаемости в присутствии гликозидов.

Стеринзависимость в действии гликозидов на проницаемость мембран проявляется в изменении проницаемости мембран в зависимости от вида и количественного содержания стеринов мембранах. Обнаружено, что эффективность действия гликозидов на клетки коррелирует с их действием на проницаемость липосомалытых мембран []. Гемолитическая активность гликозидов в настоящее время наиболее хорошо изучена [, ПО].

В работе Трона [] впервые проведено сравнительное изучение гемолитической активности гликозидов гол останов ого, амирииового и спиростанового рядов. Показано, что гликозид морского происхождения голостанового ряда голотурии А является наиболее сильным гемолитиком по сравнению с растительными гликозидами.

В действии гликозидов на эритроциты имеются как общие черты, так и существенные различия. Обнаружено, что концентрация гликозида, при которой начинается гемолиз, зависит от концентрации клеток. Обнаруженные различия в действии гликозидов на эритроциты автор связывает с особенностями химического строения гликозидов и их способностью вызывать изменения в структуре клеточных мембран.

Отмечено, что в некоторых случаях не наблюдается корреляция между гемолитической активностью и сродством гликозида к холестерину. Известно, что гемолитическая активность гликозидов ингибируется свободным холестерином, плазмой крови и липидами [].

Показано, что наиболее высокой нейтрализующей активностью обладает холестерин. Для нейтрализации активности гликозидов требуется в 20 и 30 раз большее количество молекул лецитина или альбумина, соответственно, чем молекул холестерина.

Обнаружено, что гемолитическую активность некоторых гликозидов ингибируют свободные агликоны генины тритерпенових и стероидных гликозидов []. Ингибирующая активность генинов различна и была ниже, чем у холестерина. В случае гликозидов хедерагенина не наблюдалось ингибиругощсго действия генинов. По-видимому, это связано с частичной ионизацией карбоксильной группы в гликозидах хедерагенина и генинов при рН 6,5 и их электростатическим отталкиванием.

Гликозид с метилированной карбоксильной группой ингибировался генинами []. Показано, что генины при введении в мембраны также, как холестерин, повышают чувствительность мембран к действию гликозидов.

Связь между структурой и гемолитической активностью производных олеаноловой кислоты проанализирована в работе []. Показано, что бисдссмозиды обладают слабой гемолитической активностью. Удаление углеводной части в положении С увеличивает активность гликозида в 30 раз, а метилирование карбоксильной группы увеличивает активность в 10 раз.

Удаление углеводной цепи по С-3 приводит к полной потери активности. В работе японских авторов [27] изучены гемолитическая активность гликозидов различного строения, влияние их на проницаемость липосом и ингибирование гемолиза липосомами различного липидного состава.

Показано, что гликозиды с двумя углеводными цепями не обладают гемолитической активностью и не изменяют проницаемость липосом до концентрации "4М.

Гликозиды, вызывающие гемолиз, увеличивают проницаемость фосфатидилхолиновых липосом, содержащих холестерин. Поэтому, по мнению авторов, мишенью этих гликозидов в эритроцитарных мембранах является холестерин. Обнаружено, что прсинкубация гликозидов с липосомами, содержащими холестерин, ингибирует гемолиз. Показано, что особенностью гликозида даммаранового ряда является то, что его действие направлено на фосфатидилхолиновый бислой, а холестерин защищает мембраны от действия гликозида.

Стероидный гликозид спир останов ого ряд, напротив, не действует на липосомы без стерина. Чувствительность липосом к действию стероидного гликозида возрастает с увеличением содержания холестерина в мембранах. БЛМ получали по методу Мюллера [] из 0. Стерины, свободные тритерпеыоиды и стероиды вводили в формирующий раствор в определенном мольном отношении к липиду. Омическое сопротивление БЛМ измеряли на постоянном токе. Ток через БЛМ измеряли в режиме фиксации потенциала на мембране.

Флуктуации тока через БЛМ в присутствии исследуемых соединений измеряли по стандартной методике в режиме фиксации потенциала на мембране. Измерительный тракт позволял регистрировать флуктуации тока величиной до 10" 3А и длительностью до 0,5 секунд.

Для устранения микрофонного эффекта БЛМ, обусловленного механическими колебаниями, установка виброизолировалась. Сопротивление БЛМ Rm рассчитывали из соотношения: Значение удельной электропроводности БЛМ определяли по формуле: Проводимость одиночного канала g определяли по формуле: Наиболее вероятную проводимость канала находили из гистограмм распределения величины проводимости от до каналов, образованных исследуемыми соединениями.

Среднее время нахождения ионных каналов в открытом состоянии г определяли из графика зависимости, построенного в логарифмическом масштабе,. Значение lnNn на графике соответствует точке пересечения прямой с осью ординат. Электромеханическую стабильность БЛМ оценивали по величине разности потенциалов на мембранах, при которой наблюдается их разрушение.

Значение рН водной фазы внутри измерительной ячейки контролировали с помощью комбинированного микроэлектрода "Orion " США. Платиновую квадратную рамку с размером ребра, равным 2 см, взвешивали на торсионных весах ВТ без пленки и с цветной пленкой, полученной после продавливания рамки через границу раздела. Расчет о проводили согласно [] по формуле: Значение рассчитывали по данным независимых измерений в каждой точке.

Мультислойные липосомы для изучения термотропного поведения липидных мембран получали по стандартной методике []. Липидную пленку получали, высушивая на роторном испарителе раствор с заданной концентрацией дипальмитоилфосфатидилхолина ДПФХ в свежеперегнанном хлороформе.